标准号：T/CGTA 11-2025
标准名称：大豆转基因成分的快速检测 环介导等温扩增（LAMP）检测法
团体名称：中国粮食商业协会
发布日期：2025年08月01日
实施日期：2025年08月01日
6.1试剂
除另有说明外，所有试剂均为分析纯或生化试剂，实验室用水应符合GB/T6682中的一级水的要求。
6.1.11MTris-HCl（pH8.0）。
6.1.20.5MEDTA（乙二胺四乙酸二钠，pH8.0）。
6.1.3NaCl（氯化钠）。
6.1.4CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）。
6.1.51MHCl（盐酸）。
6.1.610MNaOH（氢氧化钠）。
6.1.7dNTPs溶液：每种核苷酸浓度10mmol/L。
6.1.8BstDNA聚合酶大片段（如：NEB公司或具有同等效果的DNA聚合酶）：酶浓度8U/μL。
6.1.910×ThermoPolReactionBuffer：含200mmol/LTris-HCl（pH8.8）、100mmol/LKCl、100mmol/L(NH4)2SO4、20mmol/LMgSO4、1%TritionX-100。
6.1.10MgSO4溶液：150mmol/L。
6.1.11甜菜碱溶液：5mol/L。
6.1.12酚红溶液：10%。
6.1.13引物：内源基因、CP4-EPSPS、G2-EPSPS和G10evo-EPSPS环介导等温扩增（LAMP）检测方法作用引物见表1。
6.2溶液配制
6.2.1裂解液：量取10mL1MTris-HCl（pH8.0）（6.1.1）、0.8mL0.5MEDTA（pH8.0）（6.1.2），称取81.86gNaCl（6.1.3）、2gCTAB（6.1.4）加入烧杯中，加入约800mL水，搅拌溶解。用盐酸（6.1.5）或NaOH（6.1.6）调节pH至8.0，加水定容至1L，混匀。
6.2.2复溶液：量取10mL10MTris-HCl（pH8.0）（6.1.2）、2mL0.5MEDTA（pH8.0）（6.1.3），加入烧杯中，加入800mL水，搅拌混匀。用盐酸（6.1.5）或NaOH（6.1.6）调节pH至8.0，加水定容至1L，混匀。
6.2.3扩增反应液：内源基因、CP4-EPSPS、G2-EPSPS和G10evo-EPSPS环介导等温扩增（LAMP）反应液配制见表2。分别配制各检测基因扩增反应液后按照25μl/管分装至0.2mL离心管中，-80℃快速冷冻30min，预冷冻后的试剂转移至冻干机-40℃保持2h，启动真空泵将压力降至0.1mBar以下，缓慢升温（0.5℃/min）至-20℃，使冰晶逐渐升华。再将温度（0.2℃/min）逐渐升至20℃，保持真空状态2h后关闭真空泵，充入惰性气体恢复常压。取出冻干后的试剂，盖上离心管盖。
7 样品制备
7.1抽样和制样
粮食样品扦样采样操作按照GB/T5491进行，采集样品的制备按照GB/T19495.7进行。
7.2样品前处理
7.2.1裂解：取0.20g±0.05g籽粒粉末于5mL离心管中，加4mL裂解液（6.2.1），上下颠倒混匀（或涡旋混匀30s），此为样品裂解液。
7.2.2复溶：取25μL样品裂解液（7.2.1）加入一个新的1.5mL的离心管中，再向离心管中加入1mL复溶液（6.2.2），上下颠倒混匀（或涡旋混匀30s），备用。此为样品复溶液。
8 样品测定
8.1试液配制
更换移液器吸头，取25μL样品复溶液（7.2.2）加入提前准备好扩增反应液（6.2.3）的冻干管中，换4联管盖，盖紧管盖后上下颠倒混匀（或涡旋混匀30s），用手将液体甩至管底（注意液体不要有气泡）。
8.2核酸扩增
将试液（8.1）置于65℃水浴锅（5.1）中恒温扩增30min，反应结束。
8.3结果判定
8.3.1质量控制
内源基因检测试剂应为黄色或橘黄色，如不符合应重新进行试验。
8.3.2结果判断
内源基因检测试剂为黄色或橘黄色，外源基因检测试剂为红色时，判定该样品不含所检基因，可表述为“未检出×××基因”。
内源基因检测试剂为黄色或橘黄色，外源基因检测试剂为黄色或橘黄色时，判定该样品含有所检基因，应按照GB/T19495.4标准确证实验结果，再根据确证结果判断和表述。
起草单位：百沃特（天津）生物技术有限公司、中粮营养健康研究院有限公司、北大荒粮食集团有限公司、黑龙江象屿农业物产有限公司、通标标准技术服务（青岛）有限公司。
起草人：马增彬、钱承敬、仉磊、刘晓萌、王健、李俊、于旭德、韩冀、杨若松、龚雅云。