标准号：T/QHNX 059-2026
标准名称：甘蓝型春油菜小孢子培养及加倍技术规范
团体名称：青海省农学会
发布日期：2026年04月09日
实施日期：2026年04月15日
4 供体种植条件
供体可种植在大田、温室、人工气候室等场所。大田具备基本的种植土壤及浇灌条件；温室具备供暖、保温、通风、浇灌设备；人工气候室具备精确的控温、控光系统。
5 供体种植及取样
5.1 供体种植
5.1.1 大田
大田供体材料从3月~5月分批播种，每批材料种植间隔15d，水肥统一管理，病虫害防治按DB63/T943规定进行。
5.1.2 温室
温室从9月中下旬开始种植，温度控制在15℃~25℃，12月中旬开花时，温度控制在8℃~15℃。水肥统一管理，病虫害防治按DB63/T943规定进行。
5.1.3 人工气候室
人工气候室全年种植，开花时，温度控制在10℃~18℃。昼/夜温度设定为18/10℃。水肥统一管理，病虫害防治按DB63/T943规定进行。
5.2 取样
5.2.1 取材时间
供体植株初花至盛花期取样，选取健康植株的主花序或生长状态较好的分支花序，用冰盒运送至培养基地。
5.2.2 小孢子发育时期确定
选取大小2.5mm~3.2mm的花蕾。通过镜检，选取单核晚期至双核早期的小孢子。
5.2.3 花蕾消毒
a) 用有效氯成分4.5%~5.5%的消毒液（84液），表面消毒15min，然后用无菌水清洗3次，每次5min。
b) 用75%的酒精表面消毒1min，再用升汞消毒8~10min，最后用无菌水清洗3次，每次5min。
6 培养基的配置及灭菌
6.1 配置
见附录A。
6.2 灭菌
6.2.1 抽滤灭菌
NLN-13培养基应抽滤灭菌。先用真空泵和抽滤罐，分别用0.8m，0.22m孔径的混合纤维素酯膜（MCE）对培养基进行初步过滤，再通过无菌过滤器和蠕动泵，过滤、分装到无菌容器中，25℃静置24h后使用。
6.2.2 高温高压灭菌
B5-13、B5、MS培养基，应采用高温高压灭菌，121℃，103.4kPa，20min。
7 小孢子培养方法
7.1 小孢子提取
步骤如下：
1) 将表面清洗消毒后的花蕾放置于离心管中，加入30mL~40mLB5-13分离洗脱培养基，用玻璃棒研磨使花粉散出。
2) 将花粉悬浮液倒入过滤器（小漏斗和300目尼龙纱网组成），滤入50ml离心管。
3) 800~1000rpm/min，离心4min，弃上清液，再加入30mL~40mLB5-13洗脱液，重复洗脱至少2次。
7.2 胚诱导培养
步骤如下：
1) 用NLN-13培养基将收集到小孢子进行稀释，并分装到9cm培养皿中，每皿15mL~20mL，用封口膜封口。
2) 32℃黑暗热激培养48h，然后静置在25℃恒温条件下进行暗培养。
3) 10~12d左右肉眼可见胚状体形成，移至50rpm/min、25℃恒温摇床上继续进行振荡暗培养。
7.3 胚状体冷处理
将发育至5mm~10mm的子叶型胚放置在4℃条件下，处理20d。
7.4 再生植株的诱导培养
将经过低温处理的子叶型胚接种在B5固体培养基上，于25℃，16h光/8h暗，2000LUX光强条件下培养。
7.5 再生植株的继代培养
切取胚状体上的再生植株的生长点，接种在MS固体培养基上继代培养。
8 再生植株加倍
8.1 土壤基质
再生苗移植前施肥，平均每亩施有机肥160.00kg/667m2。
8.2 栽培及壮苗
再生苗在MS培养基上生长30d后，可移栽到温室土壤中。移栽初期需要用遮阴网和透明塑料杯遮光、保湿。练苗15d后，揭开遮阴网和杯子，使其在自然光照下生长。单倍体植株长出3~5片新叶时，进行染色体加倍。
8.3 单倍体苗加倍
将植株挖出，洗净根部泥土，在浓度0.3%的秋水仙碱溶液中，浸根7h。然后，将植株根部残留的秋水仙碱用流水冲洗干净，重新栽种到土壤中，灌透水，并遮光、缓苗。
8.4 施肥管理
缓苗15d后，取开遮阴网，松土、除草、去黄叶、死叶，并追施尿素3.00kg/667m2。开花后，及时拔除未能加倍的植株，再追施尿素4.00kg/667m2，加倍正常植株套袋留种。
8.5 病虫害防治
主要病害为白粉病，虫害为小菜蛾和蚜虫，防治方法按DB63/T943执行。
起草人：星晓蓉、叶景秀、赵志、李开祥、徐亮、柳海东、贺子腾、许永丽。